2024-03-28T15:21:40Z
https://jbiocontrol.areeo.ac.ir/?_action=export&rf=summon&issue=11907
مهار زیستی در گیاهپزشکی
BCPP
2322-4223
2322-4223
1396
5
1
بررسی بازدارندگی باکتریهای اندوفیت یونجه علیه باکتری بیمارگر Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus عامل پژمردگی در شرایط آزمایشگاه و گلخانه
میترا
امیدی نسب
غلام
خداکرمیان
باکتریهای اندوفیت گروه مهمی از باکتریها هستند که از طریق تولید فیتوهورمونها، تولید عوامل ضد قارچ و ضد باکتری، تولید سیدروفور، رقابت غذایی و القای مقاومت سیستمیک میزبان، باعث مهارزیستی عوامل بیماریزای گیاهی میشوند. هدف از این پژوهش دستیابی به جدایههای اندوفیت با اثر آنتاگونیستی علیه عامل پژمردگی یونجهClavibacter michiganensis subsp. insidiosus در شرایط آزمایشگاهی و گلخانه بود. بهمنظور انجام این پژوهش طی نمونهبرداریهای انجام شده، جدایههای باکتریایی از مزارع یونجه در استان همدان جداسازی شدند. سپس در شرایط آزمایشگاه، تأثیر آنتاگونیستی جدایهها علیه باکتری عامل پژمردگی یونجه بررسی شد. در شرایط آزمایشگاهی به روش کشت سه نقطهای در محیط کشت Nutrient Agarو تشکیل هالۀ بازدارنده در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. دادههای حاصل با استفاده از نرم افزار SASو مقایسۀ میانگین با آزمون چند دامنهای دانکن آنالیز شد. بر اساس بررسیهای آزمایشگاهی، هشت جدایه که دارای میانگین قطر هالۀ بازدارنده شش میلیمتر بودند، برای بررسیهای گلخانهای انتخاب شدند. در شرایط گلخانه ارزیابی اثر جدایههای باکتریایی در کنترل توسعه بیماری از طریق اندازهگیری فاکتورهای رشدی یونجه بررسی شد. نتایج نشان داد که جدایههای 8 و 56 توان کنترل بالایی داشتند؛ بهگونهای که این جدایهها در سطح احتمال 1% موجب افزایش فاکتورهای رشدی گیاه شدند. ژن کدکننده 16s rRNAجدایههای نماینده تکثیر و تعیین توالی شدند. نتایج نشان داد که جدایههایی که بیشترین درصد بازدارندگی را در شرایط آزمایشگاه و گلخانه داشتند، مربوط به جنسهای Bacillus subtilis، Pseudomonas sp.، Escherichia coli، Sphingomonas paucimobilis و Paenibacillus glycanilyticus بودند. باکتریهای اندوفیت Bacillus subtilis و Sphingomonas paucimobilis دارای عملکرد مناسب علیه باکتری بیمارگر بودند. بهگونهای که در اکثر ویژگیهای رشدی گیاه از جمله وزن تر، وزن خشک و ارتفاع بوته بیشترین تأثیر را داشتند. این تأثیر میتواند ناشی از تولید طیف وسیعی از آنتیبیوتیکها و القای مقاومت سیستمیک جدایهها در مهار زیستی بیماری پژمردگی باکتریایی در شرایط آزمایشگاهی و گلخانه و افزایش فاکتورهای رشدی گیاه باشد؛ نتایج حاصل میتواند نویدی در مدیریت و مهار زیستی بیماریهای خاکزاد باشد.
اندوفیت
آغازگر
بازدارندگی
پژمردگی باکتریایی یونجه
2017
08
23
1
13
https://jbiocontrol.areeo.ac.ir/article_116033_3b169a4e8a4161fc7a49f47d908868bf.pdf
مهار زیستی در گیاهپزشکی
BCPP
2322-4223
2322-4223
1396
5
1
مهار زیستی بیماری پاخورۀ گندم با استفاده از سویههای تولیدکنندۀ بیوفیلم باکتری Bacillus subtilis
مریم
خضری
بیماری پاخورۀ گندم از مهمترین بیماریهای قارچی خاکزاد است که هر ساله خسارتهای قابل توجهی به این محصول راهبردی در دنیا و ایران وارد مینماید. در این پژوهش، پتانسیل 27 سویه باکتری آنتاگونیست Bacillus subtilisدر مهار زیستی قارچ Gaeumannomyces graminis var. tritici، عامل بیماری پاخورۀ گندم در آزمایشگاه و گلخانه مورد ارزیابی قرارگرفت. همه سویههای مورد مطالعه در آزمون کشت متقابل در برابر قارچ بیمارگر ضمن ایجاد هاله بازدارنده، بین 48/39 تا 29/96 درصد از رشد میسلیوم قارچ جلوگیری نمودند. در آزمون تولید متابولیتهای فرار ضدقارچی، برخی سویهها رشد قارچ بیمارگر را بهمیزان 62/87% کاهش دادند که البته این مقدار برای تعدادی از سویهها کمتر از 20% بود. از بین سه غلظت 5، 15 و 25 درصد ترشحات مایع خارج سلولی، بیشتر سویهها در غلظت 25% بیشترین میزان بازدارندگی از رشد قارچ را نشان دادند. همۀ سویهها قادر بهتولید بیوسورفکتانت و بیوفیلم بودند، با این حال تنوع زیادی در بین سویههای مورد مطالعه دیده شد. میزان همبستگی بین تولید بیوسورفکتانت و بیوفیلم در آزمایشگاه، 83/0 بود. تعداد 11 سویه باکتری با توان مختلف آنتاگونیستی و تولید بیوفیلم، برای بررسی امکان مهار زیستی بیماری در گلخانه انتخاب شد که همۀ سویهها توانستند بین 20-100 درصد بیماری را کاهش دهند. 72 درصد از سویهها، بیماری را بیش از 50 درصد نسبت بهشاهد کاهش دادند. بین میزان مهار زیستی بیماری در گلخانه با تولید بیوفیلم و بیوسورفکتانت در آزمایشگاه بهترتیب 71/0 و 85/0 همبستگی وجود داشت.
توان آنتاگونیستی
بیوفیلم
بیوسورفکتانت
باسیلوس
Gaeumannomyces graminis
2017
08
23
15
30
https://jbiocontrol.areeo.ac.ir/article_116039_a0992df6019078d85b8d83591fbf999e.pdf
مهار زیستی در گیاهپزشکی
BCPP
2322-4223
2322-4223
1396
5
1
میزان شکارگری و ترجیح سن شکارگرNesidiocoris tenuis درتغذیه از تخم بید آرد، Ephestia kuehniella و تخم بید گوجهفرنگیTuta absoluta در آزمایشگاه
سید حسن
ملکشی
رضا
طلایی حسنلویی
جعفر
محقق نیشابوری
حسین
اللهیاری
تخمهای بید آرد، Ephestia kuehniella یکی از منابع غذایی غنی از پروتئین برای تولید انبوه دشمنان طبیعی و بهویژه سنNesidiocoris tenuis میباشد که از آن بهعنوان طعمۀ جایگزین برای استقرار سن شکارگر در گلخانههای گوجهفرنگی استفاده میشود. مقایسۀ میزان شکارگری و ترجیح سنN. tenuis روی تخمهای بیدآرد و بیدگوجهفرنگی Tuta absoluta با آزمایش فاکتوریل بر پایۀ طرح کاملاً تصادفی در شرایط آزمایشگاهی انجام شد. نتایج نشان داد که جنسیت شکارگر و نوع طعمه بهصورت معنیداری در میزان شکارگری مؤثر هستند. میزان تغذیه سن ماده طی 24 ساعت از تخمهای بیدآرد و بیدگوجهفرنگی بهترتیب 83/4±58 و 83/4±50/77 عدد و بیانگر اختلاف معنیدار بین آنها بود. میزان تغذیۀ سن نر از تخمهای بیدآرد و بیدگوجهفرنگی نیز بهترتیب 83/4±5/27 و 09/5±44/61 عدد بود که تفاوت معنیداری مشاهده شد. در آزمون ترجیح طعمه نیز سن ماده به ترتیب از 63/3±3/41 و 20/3±8/29 عدد تخم بیدآرد و بیدگوجهفرنگی تغذیه کرد که تفاوت معنیداری مشاهده نشد. مقادیر متناظر برای جنس نر بهترتیب 53/1±33/14 و 39/2±33/20 عدد بود که بیانگر اختلاف معنیدار در سطح احتمال 5 درصد بود. در حشرات ماده، شاخص بتای منلی (Manly) بید آرد (طعمۀ I) و بید گوجهفرنگی (طعمۀ II) بهترتیب معادل 07/0±64/0 و 08/0± 36/0 بهدست آمد که بیانگر ترجیح تغذیۀ سن ماده نسبت به بیدآرد بود. در حالیکه در حشرات نر به ترتیب برابر با 02/0± 38/0 و 04/0±62/0 برای بید آرد و بید گوجه فرنگی بهدست آمد که نشان دهندۀ ترجیح تغذیه سن نر به بید گوجهفرنگی بود. بنابراین بر اساس شاخص بتای منلی، سن ماده ترجیح بیشتری به تغذیه از تخم بیدآرد دارد تا نیازهای غذایی خود را تأمین کند. لذا میتوان در رهاسازی سن شکارگر N. tenuis در گلخانههای گوجهفرنگی در کمبود یا غیاب طعمۀ اصلی از تخمهای بیدآرد بهعنوان مادۀ غذایی جایگزین استفاده کرد.
ترجیح طعمه
سن شکارگر
Nesidiocoris tenuis
غذای جایگزین
کنترل بیولوژیک
گوجهفرنگی
2017
08
23
31
43
https://jbiocontrol.areeo.ac.ir/article_116040_dcd5908634465b7c30a80a451dbc699c.pdf
مهار زیستی در گیاهپزشکی
BCPP
2322-4223
2322-4223
1396
5
1
زیستشناسی سرخرطومی Lixus fasciculatus بهعنوان مهارکنندۀ درمنه وحشی، Artemisia vulgaris در منطقۀ ارومیه
سعید
شهند
یونس
کریمپور
زیستشناسی سرخرطومی ساقهخوار درمنۀ وحشی Lixus fasciculaus Boheman (Col., Curculionidae) روی Artemisia vulgaris L. (Asteraceae) در اطراف ارومیه مورد مطالعه قرارگرفت. نتایج نشان داد که این سرخرطومی یک نسل در سال دارد و به شکل لارو کامل داخل ساقههای خشکیده گیاه میزبان زمستانگذرانی میکند. خروج حشرات کامل از اواسط اردیبهشت ماه آغاز میشود و پس از خروج، از برگهای تازه گیاه میزبان تغذیه و در طول زندگی خود بهطور متناوب جفتگیری میکنند. سرخرطومیهای ماده، با حفر سوراخی در ساقه درمنه تخمهای خود را بهصورت انفرادی درون ساقهها قرارداده و روی آنها را با بقایای گیاهی حاصل از جویدن ساقهها میپوشانند. میانگین باروری حشرات مادۀ سرخرطومی 6/4±4/23 تخم (دامنه 17 تا 32 تخم) برآورد شد. در شرایط طبیعی دورۀ رشد و نمو جنینی 8/1±3/8 روز (دامنه 6 تا 11 روز) طول کشید. لارو جوان پس از خارج شدن از تخم، با سوراخ کردن و نفوذ به درون ساقه از بافتهای داخلی آن تغذیه میکند. لارو کاملاً رشد یافته یک حفره شفیرگی در درون ساقه ایجاد و نهایتاً در آنجا به شفیره تبدیل میشود. کامل شدن دوره لاروی بیش از 10 ماه طول میکشد. لاروهای کامل تا دهۀ اول اردیبهشت ماه سال بعد در داخل ساقه باقی مانده و از اواخر فروردین شفیره شدن آنها آغاز میشود. بسته به شرایط آب و هوایی کامل شدن دورۀ شفیرگی 5/4±2/13 روز (دامنه 11 تا 19 روز) طول میکشد. حشرات کامل نسل جدید از اوایل اردیبهشت ماه ظاهر میشوند. در منطقۀ ارومیه لاروهای سرخرطومی L. fasciculatus توسط زنبورهای پارازیتوئیدRhaconotus aciculatus Ruthe, 1854 وSchizoprymnus telengai Tobias, 1976 (Hym.: Braconidae) و Eurytoma ussuriensis Zerova (1995) (Hym.: Eurytomidae) انگلی میشوند. ارتباط سرخرطومی L. fasciculatus با پارازیتوئیدهای ذکر شده و انتشار زنبورهای S. telengai و E. ussuriensisدر ایران نیز برای اولینبار گزارش میشود.
درمنۀ وحشی
سرخرطومی Lixus fasciculatus
زیستشناسی
پارازیتوئید
ارومیه
2017
08
23
45
57
https://jbiocontrol.areeo.ac.ir/article_116070_3b9996cc1ca991dd5e056b4492253beb.pdf
مهار زیستی در گیاهپزشکی
BCPP
2322-4223
2322-4223
1396
5
1
خاموشی حدنصاب حسگری باکتریها توسط عصارۀ گیاهان و تأثیر آن بر بیماریزایی باکتری Pectobacterium carotovorum
اسماعیل
محمودی
باکتریها از یک مکانیسم مولکولی پیشرفته بهنام حدنصاب حسگری یا quorum sensing برای تنظیم بیان ژنها و برنامهریزی فعالیتهای اجتماعی در جمعیت استفاده میکنند. این پدیده همراه با تولید مولکولهای کوچک پیامرسان مانند اسیل هموسرین لاکتون است و فرآیندهای بیولوژیک بسیار مهمی از جمله تولید بیوفیلم، آنتیبیوتیک و فاکتورهای بیماریزایی را تنظیم میکند. بعضی گیاهان بهدلیل ارتباط طولانی مدت با باکتریها قادر به تولید ترکیباتی هستند که فعالیتهای وابسته به حدنصاب حسگری باکتریها را سرکوب میکنند. در این پژوهش فعالیت مختلکنندگی سیستم حدنصاب حسگری در عصارۀ متانولی 25 گونه گیاهی با استفاده از باکتری گزارشگر Chromobacterium violaceum CV026 در حضور پنج میلیگرم در لیتر مولکول سیگنال C6-AHL در محیط کشت لوریا برتانی ردیابی شد. نتایج نشان داد عصارههای گیاهان گشنیز Coriandrum sativum،شیرینبیان Glycyrrhiza glabra، منداب Eruca sativa، ختمی Althea officinalis و کرفسکوهی Kelussia odoratissima، تولید رنگدانه ویولاسئین در باکتری C. violaceum CV026 را سرکوب کرده و باعث تشکیل پرگنههای روشن باکتری گزارشگر در اطراف چاهک عصارهها شدند. عصارههای کرفسکوهی و منداب با اثر تخریبی در فعالیت پروتئینهای LuxI و LuxR باکتری گزارشگر، بیشترین تأثیر را در سرکوب حدنصاب حسگری داشتند. در این پژوهش غدههای ضدعفونی شده سیبزمینی با سوسپانسیون cfu/ml 106 باکتری Pectobacterium carotovorum و عصارههای گیاهی تلقیح و بهمدت 72 ساعت در دمای 30 درجۀ سلسیوس و رطوبت نسبی 80 درصد قرار داده شدند. نتایج نشان داد غدههای تیمار شده با عصارۀ گیاهان شیرینبیان و منداب کاهش شدید علائم پوسیدگی نرم (بیش از 60 درصد) را نشان دادند. این گیاهان حاوی ترکیباتی هستند که با اختلال در حدنصاب حسگری، تولید آنزیمهای پکتینولیتیک را در باکتری پکتوباکتریوم مختل میکنند.
آنزیمهای پکتینولیتیک
N-اسیل هموسرین لاکتون
حدنصاب حسگری
Chromobacterium violaceum CV026
2017
08
23
59
70
https://jbiocontrol.areeo.ac.ir/article_116071_08270e9f0c5f05a0220fce354b2e0466.pdf
مهار زیستی در گیاهپزشکی
BCPP
2322-4223
2322-4223
1396
5
1
ارزیابی کارآیی جدایههای تریکودرما در مهارزیستی بیماری پوسیدگی ذغالی سویا در شرایط آزمایشگاه و گلخانه
رضاپور
مهدی علمدارلو
آیدین
حسن زاده
علی زمان
میرآبادی
کامبیر
فروزان
سویا مهمترین دانۀ روغنی در دنیا بهحساب میآید. یکی از بیماریهای شایع سویا پوسیدگی ذغالی با عامل Macrophomina phaseolinaمیباشد. مبارزۀ شیمیایی روی بیماری مؤثر نبوده و مدیریت تلفیقی آن با روشهای مختلف اهمیت زیادی دارد. در این پژوهش بهمنظور دستیابی بهجدایههای آنتاگونیست مناسب برای مهارزیستی بیماری، اثر 126 جدایه تریکودرما (Trichoderma spp.) روی قارچ بیمارگر M. phaseolina، با روشهای کشت متقابل و تأثیر ترکیبات فرّار در آزمایشگاه بررسی و 12 جدایۀ برتر برای بررسیهای گلخانهای انتخاب شد. شناسایی جدایهها براساس خصوصیات ریختشناسی و با کلیدهای معتبر انجام شد که سه جدایه Trichoderma reesei، هفت جدایهT. harzianum و دو جدایهT. atrovirideتشخیص داده شد. اثر 12 جدایۀ فوق بههمراه دو تیمار شاهد (مثبت و منفی) روی بیماری پوسیدگی ذغالی سویا در گلخانه بررسی شد. پس از سترون نمودن خاک گلدانها، بیمارگر به آن اضافه شده و جدایههای تریکودرما هنگام کاشت سویا، مایهزنی شد. برای ایجاد شرایط مناسب برای آلودگی، در اوایل گلدهی تنش خشکی در گلدانها اعمال شد. در پایان دورۀ آلودگی، میزان کاهش وقوع بیماری روی سویا و کاهش جمعیت میکرواسکلروتهای بیمارگر در خاک تعیین شد که از هر دو لحاظ بین تیمارها اختلاف معنیدار وجود داشت (01/0P<). بیشترین میزان کاهش وقوع بیماری و کاهش تعداد میکرواسکلروت در شاهد منفی (بدون ماکروفومینا و تریکودرما) مشاهده شد. جدایههای ARCTr144 (T. reesei)، ARCTr102 (T. harzianum)، ARCTr184 (T. reesei) و ARCTr105 (T. atroviride) با داشتن بیشترین میزان کاهش وقوع بیماری (75-62 درصد) و کاهش تعداد میکرواسکلروت (85-73 درصد) پس از شاهد منفی، بهعنوان تیمارهای برتر معرفی شدند.
مهار زیستی
پوسیدگی ذغالی سویا
جدایه تریکودرما
میکرواسکلروت
آلودگی
2017
08
23
71
80
https://jbiocontrol.areeo.ac.ir/article_116072_10d70fc6d37c8ecb2c1a0baf113a7997.pdf
مهار زیستی در گیاهپزشکی
BCPP
2322-4223
2322-4223
1396
5
1
جداسازی قارچهای آنتاگونیست از باغهای چای و بررسی تأثیر آنها روی نماتود مولد زخم ریشه Pratylenchus loosi در آزمایشگاه
ابوالفضل
یحیوی آزاد
علی
سراجی
علی اکبر
حجت جلالی
صمد
جمالی
درحال حاضر در بسیاری از کشورها از جمله ایران، نماتود مولد زخم ریشه Pratylenchus loosi مهمترین عامل خسارتزای چای محسوب میشود. بهمنظور مهار زیستی این نماتود با استفاده از قارچهای آنتاگونیست، نمونهبرداری از خاک و ریشه درختچههای چای در بهار و تابستان 1392 در مناطق چایکاری استانهای گیلان و مازندران صورتگرفت. جدایههای مختلفی از قارچها از نمونههای خاک و یا از نماتودهای انگلی شده جداسازی و شناسایی شدند. این جدایهها شاملPaecilomyces lilacinus (T1, N1, N3)، Fusarium culmorum، F. graminearum، Cladosporium sp.، Trichoderma harzianum (T1, T2, T3) بودند. آزمایشهای مربوط بهآنتاگونیستی این قارچها علیه نماتود P. loosi در محیط آب آگار 5/1 درصد انجام شد و درصد مرگ و میر سنین لاروی و نماتود بالغ P. loosi در سه فاصله زمانی 48، 72 و 168 ساعت (یک هفته) بررسی و ثبت شد. از میان 11 جدایه مورد آزمایش، پس از یک هفته جدایۀ ((T1 قارچ P. lilacinus، با ایجاد 64 و 29 درصد و جدایۀ (N1) P. lilacinus با 47 و 24 درصد مرگ و میر بهترتیب در سنین لاروی و نماتود بالغ P. loosi با تفاوت معنیداری بالاترین میزان مرگ و میر را نسبت بهسایر تیمارها بهخود اختصاص دادند. ضمناً در این بررسی هیچ کدام از جدایههای قارچ Trichoderma harzianum در مقایسه با شاهد تأثیری در مهار زیستی نماتود مورد بحث نداشتند.
چای
مهار زیستی
نماتود مولد زخم ریشه
Pratylenchus loosi
Paecilomyces lilacinus
2017
08
23
81
91
https://jbiocontrol.areeo.ac.ir/article_116073_76975f2e3599e8e441fdef503c4e8226.pdf
مهار زیستی در گیاهپزشکی
BCPP
2322-4223
2322-4223
1396
5
1
بررسی تأثیر روغن ولک بر کفشدوزکهایCryptolaemus montrouzieri و Chilocorus bipustulatus
امیرحسین
طورانی
حبیب
عباسی پور شوشتری
مهدی
قادری
کفشدوزک Muls. Cryptolaemus montrouzieri و کفشدوزک نقابدار دولکهای،Chilocorus bipustulatus (L.) از جمله شکارگرهای مهم شپشکهای خانوادۀ Diaspididae و Eriococcidae در ایران میباشند. از جمله روشهای شیمیایی مبارزه با شپشکها استفاده از روغنهای معدنی بوده که سازگاری بالاتری با محیط داشته و با سرعت نسـبتاً زیادی در محیط از بین رفته و خطر بـروز مقاومـت یـا طغیـان آفـات ثانویه در رابطه با این ترکیبات بسیار کم است. در این مطالعه اثر روغن ولک روی حشرۀ کامل و سنین مختلف لاروی کفشدوزک C. montrouzieri و C. bipustulatus روی برگهای مرکبات در شرایط باغ مورد برررسی قرارگرفت. ابتدا سنین مختلف لاروی و حشرات کامل کفشدوزکهای مزبور بهصورت جداگانه رهاسازی و سپس با غلظتهای 5/0، 1 و 5/1 درصد روغن ولک و آب (شاهد) روی برگها اسپری و پس از 24 ساعت تعداد حشرات مرده و زنده شمارش شد. نتایج نشان داد که در سطح احتمال 5 درصد اختلاف معنیداری بین اثر غلظتهای مختلف و در تمام مراحل سنی هر دو کفشدوزک وجود دارد. غلظت 5/1 درصد دارای بیشترین مرگومیر، بهترتیب بهمیزان 11/1±16/92 و 24/1±83/96 درصد در لارو سن اول کفشدوزکهای C. montrouzieri و C. bipustulatus بود. براساس نتایج و مقایسۀ آن با معیارهای ارزیابی سازمان بینالمللی مبارزۀ بیولوژیک (IOBC)، درصد مرگومیر غلظتهای ١ و 5/0 درصد روغن ولک در اکثر مراحل سنی برای هر دو گونه کفشدوزک در ردۀ دوم گروهبندی اثرات جانبی آفتکشها (با خطر متوسط) قرارگرفتند.
مرکبات
Cryptolaemus montrouzieri
Chilocorus bipustulatus
شکارگر
روغن ولک
2017
08
23
93
97
https://jbiocontrol.areeo.ac.ir/article_116074_ef04bfd774c175cdd5e22786a37cd69e.pdf
مهار زیستی در گیاهپزشکی
BCPP
2322-4223
2322-4223
1396
5
1
اولین گزارش زنبور Tetramesa phragmitis (Hymenoptera: Eurytomidae) از ایران
یونس
کریمپور
زنبور ساقهخوار نی، Tetramesa phragmitis (Erdös, 1952) برای اولینبار از ایران گزارش میشود. نمونههای این زنبور طی بررسی عوامل مهار زیستی گیاه نی،Phragmites australis (Cav.)(Poaceae) در استان آذربایجان غربی از ارومیه جمعآوری و شناسایی شد. این گونه، در منطقۀ Trans- Palaearctic انتشار دارد.
زنبور ساقهخوار نی
Tetramesa phragmites
ارومیه
2017
08
23
99
102
https://jbiocontrol.areeo.ac.ir/article_116075_e0180eee3daef80b5c8f85a2530739ee.pdf